Brainbow - Brainbow

Lichman va Sanesdan sichqonchani uchta neyroni, 2008 y

Brainbow bu shaxs tomonidan amalga oshiriladigan jarayondir neyronlar ichida miya lyuminestsent oqsillar yordamida qo'shni neyronlardan ajralib turishi mumkin. Ning qizil, yashil va ko'k hosilalarining turli nisbatlarini tasodifiy ravishda ifodalash orqali yashil lyuminestsent oqsil individual neyronlarda har bir neyronni o'ziga xos rang bilan belgilash mumkin. Ushbu jarayon sohaga katta hissa qo'shdi konnektomika, an'anaviy ravishda miyada asabiy aloqalarni o'rganadigan hodologiya deb nomlanadi.

Texnika dastlab 2007 yilda boshchiligidagi guruh tomonidan ishlab chiqilgan Jeff W. Lixtman va Joshua R. Sanes, ikkalasi ham Garvard universiteti.[1] Asl texnika yaqinda boshqa model organizmlar, shu jumladan foydalanish uchun moslashtirildi Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans[iqtibos kerak ], va Arabidopsis talianasi.[2]

Ilgari yorliqlash usullari bir nechta neyronlarni xaritalashga imkon bergan bo'lsa, ushbu yangi usul 100 dan ortiq turli xil xaritada tasvirlangan neyronlarni bir vaqtning o'zida va shu tarzda differentsial yoritishga imkon beradi. Olingan tasvirlar juda ajoyib bo'lishi mumkin va ilmiy fotografiya tanlovlarida mukofotlarga sazovor bo'lgan[iqtibos kerak ].

Tarix va rivojlanish

Smit, 2007 yildagi sichqonchani neyronlarining miya kamari

Brainbow neyroimaging texnikasi dastlab tadqiqotchilar guruhi tomonidan ishlab chiqilgan Garvard universiteti 2007 yilda.[1] O'sha paytda ular Sent-Luisdagi Vashington universitetida ishlashgan. Ushbu alohida olimlar guruhini molekulyar va hujayra biologiyasiga ixtisoslashgan va o'z ishlari bilan mashhur bo'lgan professorlar Jeff W. Lixtman va Joshua R. Saneslar boshqargan. Jamoa Brainbow-ni ikki bosqichli jarayon yordamida qurdi: birinchidan, aniq genetik amalga oshirilayotgan ma'lum lyuminestsent oqsillar (XFP) asosida uchta yoki to'rtta ranglardan birini ishlab chiqarish uchun bir nechta tartibda birlashtirilishi mumkin bo'lgan konstruktsiya ishlab chiqarildi.[3] Keyinchalik, bir xil nusxada transgenik ga konstruktsiya kiritildi genom maqsadli turlarning, natijada turli xil XFP nisbatlarini tasodifiy ifodalashga olib keladi va keyinchalik boshqacha sabab bo'ladi hujayralar turli rangdagi ranglarni namoyish qilish.[3]

Brainbow dastlab an'anaviyga nisbatan takomillashtirish sifatida yaratilgan neyroimaging Golgi binoni va bo'yoqlarni in'ektsiya qilish kabi usullar, ikkalasi ham tadqiqotchilarga murakkab me'morchiligini tasavvur qilish qobiliyatida jiddiy cheklovlarni keltirib chiqardi. asab tizimlari ichida miya.[1] Qadimgi usullar hujayralarni faqat ranglarning tor doirasi bilan bo'yashga qodir edi, ko'pincha ikki va uch ranglardan foydalangan transgen sichqonlar neyronlarning tuzilmalari bo'yicha cheklangan ma'lumotni ochish uchun, Brainbow olimlarning aniqlanishi va hatto farqlanishi uchun 100 ga yaqin turli xil ranglarga ega bo'lgan individual neyronlarni lyuminestsent tarzda yorliqlash imkoniyatiga ega ekanligi bilan ancha moslashuvchan. dendritik va aksonal jarayonlar.[3] Neyronlarning aloqasi va naqshlari, ba'zan hatto in Vivo jonli ravishda haqida bunday batafsil ma'lumotlarni oshkor qilish orqali olimlar ko'pincha neyronlarning o'zaro ta'sirlari va ularning xulq-atvori va funktsiyasiga keyingi ta'siri haqida ma'lumot berishlari mumkin. Shunday qilib, Brainbow oldingi neyroimaging usullari qoldirgan bo'shliqni to'ldirdi.

Brainbow yaqinda paydo bo'lishi bilan nevrologiya, tadqiqotchilar endi asab zanjirlarining o'ziga xos xaritalarini tuzishlari va ularning turli xil aqliy harakatlar va ularning bog'liq xatti-harakatlari bilan qanday bog'liqligini yaxshiroq tekshirishga qodir (ya'ni Brainbow neyronlarning o'zaro bog'liqligi va ularning keyingi o'zaro aloqalari haqida ma'lumot beradi). Ushbu usulning qo'shimcha ekstrapolyatsiyasi sifatida, shuning uchun Brainbow asabiy xaritalardagi farqlarni tahlil qilish orqali ham nevrologik, ham psixologik kasalliklarni o'rganish uchun ishlatilishi mumkin.[3]

Usullari

Genetik konstruktsiyaning uchta nusxasi ko'plab florofor rang kombinatsiyalarini ifodalashga imkon beradi. Lawson Kurts va boshq. / Dyuk universiteti
Brainbow1 asosiy genetik tuzilishi. Lawson Kurts va boshq. / Dyuk universiteti

Brainbow texnikasi Cre-Lox rekombinatsiyasi, unda protein Rek Rekombinaza haydovchilar inversiya yoki eksizyon DNK loxP saytlari o'rtasida. Original Brainbow usuli cre / lox rekombinatsiyasining turli shakllaridan foydalanadigan Brainbow-1 va Brainbow-2 ni o'z ichiga oladi. Brainbow-3, o'zgartirilgan versiyasi Brainbow-1, 2013 yilda ishlab chiqilgan.[4] Barcha Brainbow subtiplari uchun berilgan XFP ifodasi stoxastik yoki tasodifiy hodisa.

Brainbow-1 foydalanadi DNK tuzilishi mutant va kanonik loxP shakllari bilan ajratilgan turli xil lyuminestsent oqsil genlari (XFP) bilan. Bu o'zaro eksklyuziv imkoniyatlar to'plamini yaratadi, chunki ular vositachilik qiladi rekombinatsiya faqat bir xil loxP saytlari orasida bo'ladi.[1] Rekombinatsiya sodir bo'lgandan keyin to'g'ridan-to'g'ri qolgan lyuminestsent oqsil targ'ibotchi noyob tarzda ifoda etilgan. Shunday qilib, uch xil loxP uchastkalari bilan ajratilgan to'rtta XFP bo'lgan konstruktsiya, uchta eksizyon hodisasi va asl konstruktsiya to'rt xil lyuminestsent oqsillarni hosil qilishi mumkin.[3]

Brainbow-2 ma'lum bir konstruktsiyada bir nechta ifoda imkoniyatlarini ta'minlash uchun Cre eksizyoni va inversiyasidan foydalanadi. Ikki qarama-qarshi yo'naltirilgan XFP bo'lgan bitta DNK segmentida Cre tasodifiy inversiya hodisasini keltirib chiqaradi, bu esa bitta lyuminestsent oqsilni ekspression uchun mos yo'nalishda qoldiradi. Agar ushbu teskari ketma-ketliklarning ikkitasi hizalansa, uch xil inversiya hodisasi mumkin. Eksizyon hodisalari ham ko'rib chiqilganda, to'rtta lyuminestsent oqsillardan biri Crening eksizyonlari va inversiyalarining ma'lum birikmasi uchun ifoda etiladi.

Brainbow-3 Brainbow-1 loxP formatini saqlab qoladi, ammo RFP, YFP va CFP genlarini mOrange2, EGFP va mKate2 bilan almashtiradi. mO2, EGFP va mK2 ularning lyuminestsent qo'zg'alishi va emissiya spektrlari minimal darajada ustma-ust tushganligi sababli ham, ular minimal ketma-ketlik gomologiyasiga ega bo'lganligi sababli tanlangan, bu ularni aniqlash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan selektiv antikorlarni ishlab chiqishga imkon beradi. immunohistokimyoviy protokollar. Brainbow-3 shuningdek neyronlarning membranalariga teng ravishda olib o'tilgan XFPlarning farnesillangan hosilalarini qo'llash orqali neyronlarni XFP bilan notekis to'ldirish masalasini hal qiladi.[4]

Brainbow amalga oshiriladi jonli ravishda ikkitasini kesib o'tish orqali transgenik organizm shtammlari: biri Cre oqsilini ifodalaydi, ikkinchisi esa loxP / XFP konstruktsiyasining bir nechta versiyalari bilan o'tkaziladi. Ning bir nechta nusxalarini ishlatish transgen XFP-larni taxminan 100 xil rangdan birini bera oladigan tarzda birlashtirishga imkon beradi.[3] Shunday qilib, har bir neyron lyuminestsent oqsillarning kombinatorial va stoxastik ekspresiyasi asosida har xil rang bilan etiketlanadi.

Diferensial XFP ekspression naqshlarini ko'rinadigan ko'rinishga etkazish uchun miya tilimlari tasvirlangan konfokal mikroskopiya. A ta'sirlanganda foton har birining o'ziga xos qo'zg'alish to'lqin uzunligi bilan florofor qizil, yashil yoki ko'k kanalga to'plangan signalni chiqaradi va natijada yorug'lik kombinatsiyasi ma'lumotlarni tahlil qilish dasturi bilan tahlil qilinadi.[1] Turli xil rangdagi neyronlarning ustma-ust joylashishi murakkab nerv zanjirlarini vizual ravishda ajratish imkonini beradi.

Brainbow asosan sichqonlarda sinovdan o'tgan; ammo, yuqorida tavsiflangan asosiy texnika, 2007 yilda kiritilgan dastlabki uslub paydo bo'lganidan beri so'nggi tadqiqotlarda foydalanish uchun o'zgartirilgan.

Sichqonlar

Sichqoncha embrionidagi (b) neyronlarning miya kamari, shuningdek ba'zilari traktografik o'xshash neyronlarning tasvirlari (Chedotal va Richards, 2010)

The sichqon miyasi 75,000,000-ga ega neyronlar va inson miyasiga o'xshaydi drosophila va shunga o'xshash ushbu texnikani modellashtirish uchun boshqa keng tarqalgan ishlatiladigan organizmlar C. elegans. Sichqonlar Brainbow neyroimaging usuli muvaffaqiyatli qo'llanilgan birinchi organizmlar edi.[1] Livet va boshq. (2007) Brainbow-1 va Brainbow-2 yordamida yuqorida bayon qilingan Brainbow sichqonlarining ikkita versiyasini ishlab chiqdi.[1] To'liq xaritani yaratish va sichqoncha mushaklari aksonlarini kuzatish uchun ushbu usullardan foydalanishda o'n minglab rasmlarni to'plash va ularni birma-bir yig'ish, to'liq sxemani yaratish kerak.[3] Keyinchalik, har bir dvigatel aksonini va uning sinaptik kontaktlarini to'liq qurish uchun kuzatib borish mumkin yoqimli mushak.

Brainbow texnikasi yordamida tekshirilgan neyronlarning ko'proq misollari transgenik sichqonlar quloq mushaklarini innervatsiya qiluvchi vosita nervlarida, akson yo'llarida joylashgan miya sopi, va hipokampal dentat girus.[3]

Drosophila

Drosophila miyasining murakkabligi, taxminan 100000 neyrondan iborat bo'lib, uni Brainbow kabi neyrofiziologiya va nevrologiya texnikalarini amalga oshirish uchun ajoyib nomzod qiladi. Aslida, Stefani Xempel va boshq. (2011) Drainophila miyasidagi individual neyronlarni va turli xil neyronlarning nasllarini aniqlash uchun Brainbowni genetik maqsadli vositalar bilan birlashtirdi.[5] Genetik maqsadli vositalardan biri a GAL4 / UAS UAS-Brainbow ekspressionini boshqaradigan va ekspressionni neyronlarning kichik guruhlariga yo'naltiradigan ikkilik ekspression tizim. "Flip Out" usullaridan foydalanish reportyorlar konstruktsiyasining uyali o'lchamlarini oshirdi. Floresan oqsillarining ekspressioni, asl Brainbow singari, mos lox joylari bilan mos keladigan Cre rekombinatsiyasiga bog'liq edi. Xempel va boshq. (2011) shuningdek, endogen lyuminestsentsiyaga emas, balki epitoplarning antitel belgilariga asoslangan Brainbow (dBrainbow) o'zgarishini ishlab chiqdi.[5] Ularning konstruktsiyalarining ikkita nusxasi oltita yorqin va ajraladigan ranglarni beradi. Bu ranglarni belgilashda soddalashtirish bilan bir qatorda har bir neyronning traektoriyalarini uzoq masofalarga kuzatishga imkon berdi. Xususan, ular motorli neyronlarni antenna lobidan nerv-mushak birikmalariga qarab kuzatib borishdi va bu ularga individual neyronlarning o'ziga xos mushak maqsadlarini aniqlashga imkon berdi.

Oxir oqibat, ushbu uslub Drosophila-dagi neyronlarning elektron sxemasini samarali ravishda xaritalash imkoniyatini beradi, shunda tadqiqotchilar ushbu umurtqasiz hayvonning miya tuzilishi va uning keyingi xatti-harakatlari bilan bog'liqligi to'g'risida ko'proq ma'lumot olishlari mumkin.

Cheklovlar

Hech kimda bo'lgani kabi neyroimaging texnikasi, Brainbow uni bajarish uchun zarur bo'lgan usullardan kelib chiqadigan bir qator cheklovlarga ega. Masalan, embrion ildiz hujayralaridan transgen hayvonlarning kamida ikkita shtammini ko'paytirish jarayoni ham ko'p vaqt talab etadi, ham murakkabdir. Ikki bo'lsa ham transgenik turlari muvaffaqiyatli yaratilgan, ularning barcha nasllari rekombinatsiyani ko'rsatmaydi. Shunday qilib, bu tajriba o'tkazishdan oldin keng rejalashtirishni talab qiladi.[3]

Bundan tashqari, lyuminestsent oqsillarni ifodalashdagi tasodifiy tabiat tufayli olimlar asab tizimining yorlig'ini aniq nazorat qila olmaydilar, bu esa o'ziga xos neyronlarning yomon identifikatsiyasiga olib kelishi mumkin.

Miyaning kamonidan foydalanish sutemizuvchi populyatsiyalarga neyronlarning nihoyatda xilma-xilligi xalaqit beradi markaziy asab tizimi. Ning zichligi neyronlar aksonlarning uzun uchastkalari mavjudligi bilan birgalikda yuqori aniqlikdagi CNS ning katta hududlarini ko'rishni qiyinlashtiradi. Brainbow murakkab bo'lgan ko'p hujayrali muhit fonida bitta hujayraning o'lchamlarini tekshirishda foydalidir. Biroq, ning cheklovlari tufayli optik mikroskopiya, neyronlar orasidagi sinaptik bog'lanishlarni aniq aniqlash osonlikcha amalga oshirilmaydi. Sinaptik ulanishlarni ko'rishda optik mikroskopiyadan foydalanishni to'ldirish uchun sinaptik markerlardan foydalanish bu masalani biroz chetlab o'tmoqda.[6]

Shuningdek qarang

Adabiyotlar

  1. ^ a b v d e f g Livet, J .; Vaysman, T. A .; Kang, X.; Qoralama, R. V.; Lu, J .; Bennis, R. A .; Sanes, J. R .; Lichtman, J. W. (2007). "Asab tizimidagi lyuminestsent oqsillarni kombinatorial ekspresiyasining transgenik strategiyalari". Tabiat. 450 (7166): 56–62. Bibcode:2007 yil Tabiat ... 450 ... 56L. doi:10.1038 / nature06293. PMID  17972876.
  2. ^ Mach, Jennifer (2011-07-01). "Brainbow tizimining ukasi bilan klonal tahlil". O'simlik hujayrasi. 23 (7): 2471. doi:10.1105 / tpc.111.230710. ISSN  1532-298X. PMC  3226220.
  3. ^ a b v d e f g h men Lixtman, Jef; Jan Livet; Joshua Sanes (2008 yil iyun). "Konnektomga texnik yondashuv". Neuroscience-ning tabiat sharhlari. 9 (6): 417–422. doi:10.1038 / nrn2391. PMC  2577038. PMID  18446160.
  4. ^ a b Kay, D.; Koen, K. B .; Luo, T .; Lixtman, J. V.; Sanes, J. R. (2013). "Brainbow asboblar qutisi uchun takomillashtirilgan vositalar". Tabiat usullari. 10 (6): 540–547. doi:10.1038 / nmeth.2450. PMC  3713494. PMID  23817127.
  5. ^ a b Stefani Xempel; Phuong Chung; Kler Makkellar; Donald Xoll; Loren Looger; Julie Simpson (2011 yil fevral). "Drosophila Brainbow: asab ekspressioni naqshlarini ajratish uchun rekombinaza asosidagi lyuminestsentsiyani markalash texnikasi". Tabiat usullari. 8 (3): 253–260. doi:10.1038 / nmeth.1566. PMC  3077945. PMID  21297621.
  6. ^ Dxavale, A; Bhalla (2008). "Tarmoq va sinaps: Kajaldan 100 yil keyin". HFSP jurnali. 2 (1): 12–16. doi:10.2976/1.2835214. PMC  2640997. PMID  19404449.

Tashqi havolalar