Polimeraza zanjiri reaktsiyasini optimallashtirish - Polymerase chain reaction optimization

The polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) - bu DNKni kuchaytirish uchun molekulyar biologiya vositasi va uchun turli xil usullar PCR optimallashtirish molekulyar biologlar tomonidan PCR ishlashini yaxshilash va qobiliyatsizlikni minimallashtirish uchun ishlab chiqilgan.

Kontaminatsiya va PCR

PCR usuli juda sezgir bo'lib, bir nechta kattalik darajalari bo'yicha kuchaytirish uchun bitta reaksiyada bir necha DNK molekulalarini talab qiladi. Shuning uchun laboratoriya muhitida mavjud bo'lgan har qanday DNKning ifloslanishiga yo'l qo'ymaslik uchun etarli choralar (bakteriyalar, viruslar, yoki inson manbalari) talab qilinadi. Oldingi PCR amplifikatsiyasidan olingan mahsulotlar odatdagi ifloslanish manbai bo'lganligi sababli, ko'plab molekulyar biologiya laboratoriyalari laboratoriyani alohida hududlarga bo'lishni o'z ichiga olgan protseduralarni amalga oshirdi.[1] Bir laboratoriya maydoni PCRdan oldingi reagentlarni tayyorlash va qayta ishlashga va PCR reaktsiyasini o'rnatishga bag'ishlangan, boshqa bir joy esa, masalan, PCRdan keyin qayta ishlashga bag'ishlangan. gel elektroforezi yoki PCR mahsulotini tozalash. PCR reaktsiyalarini o'rnatish uchun ko'pchilik standart operatsion protseduralar foydalanishni o'z ichiga oladi pipetkalar bilan filtr bo'yicha maslahatlar va yangi kiygan laboratoriya qo'lqoplari, va ba'zi hollarda a laminar oqim shkafi ish stantsiyasi sifatida UV chiroq bilan (har qanday yo'q qilish uchun ekstranemultimer shakllanish). PCR muntazam ravishda a ga qarab baholanadi salbiy nazorat tajriba PCR bilan bir xil tarzda o'rnatiladigan, ammo shablon DNKsiz va eksperimental PCR bilan bir qatorda bajariladigan reaksiya.

Sartaroshlar

Ikkilamchi tuzilmalar DNK tarkibida DNK shablonini yoki primerlarini katlash yoki tugunlash mumkin, natijada mahsulot unumdorligi pasayadi yoki reaksiya ishlamay qoladi. Sartaroshlar, nukleotidlar orasidagi tayanch juftligi natijasida hosil bo'lgan ichki burmalardan iborat bo'lib, bitta zanjirli DNK ichida teskari takrorlanadi, bu ikkinchi darajali umumiy tuzilmalar va muvaffaqiyatsiz PCRlarga olib kelishi mumkin.

Odatda, primerlarda potentsial ikkilamchi tuzilmalarni tekshirishni o'z ichiga olgan primer dizayni yoki qo'shilishi DMSO yoki glitserol DNK shablonidagi ikkilamchi tuzilmalarni minimallashtirish uchun PCR-ga[2], DNKning soch tolasiga shubha qilinganligi sababli muvaffaqiyatsizlikka uchragan PCR-larni optimallashtirishda foydalaniladi.

Polimeraza xatolari

Taq polimeraza etishmaydi a 3 ′ dan 5 gacha ekzonukleaza faolligi. Shunday qilib, Taqda xato yo'q -dalillarni o'qish faoliyati Bu DNK zanjiridan yangi noto'g'ri biriktirilgan nukleotid asosini ekskizatsiyasidan iborat bo'lib, u DNKni to'ldiruvchi zanjiridagi qarama-qarshi bazasiga to'g'ri kelmaydi. Taq fermentini 3 dan 5 g gacha qayta o'qishning etishmasligi yuqori xato tezligiga (tsikldagi nukleotid bo'yicha mutatsiyalar) taxminan 10000 bazadan 1 ni keltirib chiqaradi, bu PCR sadoqatiga ta'sir qiladi, ayniqsa PCRda xatolar boshlanganda kam miqdordagi boshlang'ich material, natijada kuchaytirilgan DNKning katta qismi yakuniy mahsulotda noto'g'ri ketma-ketlikda to'planib qoladi.[3]

3 dan 5 g gacha bo'lgan ekzonukleaza faolligini ishlab chiqqan bir nechta "yuqori aniqlikdagi" DNK-polimerazalar mavjud bo'lib, ular mahsulotlarni ketma-ketligi yoki klonlashi uchun PCR-larda foydalanish uchun aniqroq kuchaytirishga imkon beradi. 3 ′ dan 5 ′ gacha bo'lgan ekzonukleaza faolligi bo'lgan polimerazalarga quyidagilar kiradi: KOD DNK polimeraza, rekombinant shakli Thermococcus kodakaraensis KOD1; Olingan shamollatish Thermococcus litoralis; Pfu DNK polimeraza, dan chiqarilgan Pyrococcus furiosus; va chiqarilgan Pwo Pyrococcus woesii.[4]

Magniy kontsentratsiyasi

Magniy termostabil DNK polimeraza uchun koeffitsient sifatida talab qilinadi. Taq polimeraza magniyga bog'liq ferment bo'lib, foydalanish uchun maqbul kontsentratsiyani aniqlash PCR reaktsiyasining muvaffaqiyati uchun juda muhimdir.[5] Shablon kontsentratsiyasi, dNTPlar va mavjudligi kabi reaktsiya aralashmasining ba'zi tarkibiy qismlari xelat agentlari (EDTA ) yoki oqsillar mavjud bo'lgan magnezium miqdorini kamaytirishi mumkin, shu bilan ferment faolligini pasaytiradi.[6] Noto'g'ri shablon joylariga bog'langan primerlar magniyning haddan tashqari konsentratsiyasi mavjud bo'lganda stabillashadi va shuning uchun reaktsiyaning o'ziga xos xususiyati pasayadi. Haddan tashqari magnezium kontsentratsiyasi, shuningdek, ikkita zanjirli DNKni barqarorlashtiradi va PCR paytida mahsulot rentabelligini pasaytirganda DNKning to'liq denaturatsiyasini oldini oladi.[5][6] MgCl ning etarli darajada erishi2 ichida konsentratsiya gradyanlari hosil bo'lishiga olib kelishi mumkin magniy xloridi eritma DNK polimeraza bilan ta'minlangan va ko'plab muvaffaqiyatsiz tajribalarga yordam beradi.[6]

Hajmi va boshqa cheklovlar

PCR uzunligi ikki-uch ming taglik juftlikgacha bo'lgan DNK shablon bilan osonlikcha ishlaydi. Biroq, ushbu o'lchamdan yuqori bo'lgan mahsulot, hosilning ko'payishi bilan birga, ko'pincha kamayadi stoxastik polimeraza bilan muddatidan oldin tugatish kabi ta'sirlar PCR samaradorligiga ta'sir qila boshlaydi. Sekinroq isitish tsikli va maxsus polimerazalar bilan 50 000 tagacha juftlikdan kattaroq bo'laklarni kuchaytirish mumkin. Bu polimerazalar birlashtirilgan polimeraza DNKga yopishishini kuchaytirib, jarayonni kuchaytiruvchi DNK bilan bog'lovchi oqsilga.[7][8]

Ximerik polimerazalarning boshqa qimmatli xususiyatlari TopoTaq va PfuC2 tarkibiga termostabillik, o'ziga xosligi va ifloslantiruvchi moddalarga chidamliligi kiradi inhibitörler.[9][10] Ular noyob yordamida yaratilgan spiral-soch tolasi-spiral (HhH) ning DNK bilan bog'lanish sohalari topoizomeraza V[11] gipertermofildan Metanopir qandlari. Ximerik polimerazalar mahalliy fermentlarning ko'plab cheklovlarini engib, hujayra madaniyati va hatto oziq-ovqat namunalaridan to'g'ridan-to'g'ri PCR kuchaytirilishida qo'llaniladi, shu bilan DNKning zahmatli izolatsiyasi bosqichlarini o'tkazib yuboradi. TopoTaq polimeraza gibridining silliq siljish faolligi PCR muammolarini hal qilishga yordam beradi. soch turmalari va G yuklangan er-xotin spiral. Yuqori G-C tarkibiga ega bo'lgan Helichels eritish haroratiga ega, ko'pincha sharoitga qarab PCR ni buzadi.[12]

Maxsus bo'lmagan primer

Astarlarning o'ziga xos bo'lmagan birikmasi tez-tez uchraydi va bir necha sabablarga ko'ra yuzaga kelishi mumkin. Ular qatoriga DNK shablonidagi takroriy ketma-ketliklar, primer va shablon orasidagi o'ziga xos bo'lmagan bog'lanish, shablondagi yuqori yoki past G-C miqdori yoki to'liq bo'lmagan primer biriktirilishi kiradi va shablonga 5 'uchi biriktirilmaydi. Maxsus bo'lmagan ulanish degenerativ astarlar ham keng tarqalgan. Manipulyatsiyasi tavlash harorat va magniy o'ziga xosligini oshirish uchun ion kontsentratsiyasidan foydalanish mumkin. Masalan, magnezium yoki boshqa kationlarning quyi konsentratsiyalari o'ziga xos bo'lmagan primer o'zaro ta'sirining oldini olish va shu bilan muvaffaqiyatli PCR ni ta'minlashi mumkin. "Issiq boshlangan" polimeraza fermenti, agar u yuqori haroratgacha qizdirilmasa (masalan, 90-98˚C), uning faoliyati bloklanadi. denaturatsiya birinchi tsiklning bosqichi, odatda past haroratlarda reaktsiyani tayyorlash paytida o'ziga xos bo'lmagan astarlanishni oldini olish uchun ishlatiladi. Antikor yoki aptamer asosidagi issiq boshlanadigan PCR bilan taqqoslaganda, kimyoviy vositachilik bilan ishga tushirilgan PCRlar yuqori haroratni va polimeraza aktivatsiyasi uchun uzoqroq inkubatsiya vaqtini talab qiladi.[iqtibos kerak ]

O'ziga xoslikni oshirishning boshqa usullari kiradi Ichki PCR va Touchdown PCR.

PCR nazariy natijalarini kompyuter simulyatsiyasi (Elektron PCR ) primer dizaynida yordam berish uchun bajarilishi mumkin.[13]

Sensorli polimeraza zanjiri reaktsiyasi yoki tegib turish uslubi polimeraza zanjiri reaktsiyasi polimeraza zanjir reaktsiyasining usuli bo'lib, uning yordamida primerlar o'ziga xos bo'lmagan ketma-ketlikni kuchaytirmaydi. Polimeraza zanjiri reaktsiyasi paytida tavlanish harorati primer tavlanishning o'ziga xosligini aniqlaydi. Astarning erish nuqtasi tavlanish haroratining yuqori chegarasini belgilaydi. Ushbu nuqtadan biroz pastroq haroratda faqat primer va shablon o'rtasida juda aniq tayanch juftligi paydo bo'ladi. Pastroq haroratlarda primerlar kamroq aniq bog'lanadi. Nonspesifik primerni bog'lash polimeraza zanjiri reaktsiyasining natijalarini yashiradi, chunki kuchayishning dastlabki bosqichlarida primerlar tavlanadigan o'ziga xos bo'lmagan ketma-ketliklar har qanday o'ziga xos ketma-ketlikni "botqoqlantiradi", chunki polimeraza kuchaytirilishi.

Sensorli polimeraza zanjirli reaktsiya tsiklining dastlabki bosqichlari yuqori tavlanish haroratiga ega. Kuydirish harorati keyingi har bir tsikl uchun bosqichma-bosqich pasaytiriladi (haroratning pasayishi va individual o'sish soni eksperimentator tomonidan tanlanadi). Astar eng yuqori haroratda yonadi, bu o'ziga xos bo'lmagan majburiylikka toqat qila olmaydi. Shunday qilib, kuchaytirilgan birinchi ketma-ketlik eng katta o'ziga xoslik mintaqalari orasidagi ketma-ketlikdir; ehtimol bu qiziqishning ketma-ketligi bo'lishi mumkin. Ushbu qismlar past haroratlarda keyingi turlarda yanada kuchaytiriladi va pastki haroratlarda astarlarni bog'lashi mumkin bo'lgan o'ziga xos bo'lmagan ketma-ketliklar bilan raqobatlashadi. Agar boshlang'ich (yuqori haroratli fazalarda) qiziqish ketma-ketligiga bog'langan bo'lsa, mahsulotga ushbu qismlarni yanada kuchaytirish uchun polimeraza zanjiri reaktsiyasining keyingi turlarini bajarish mumkin.

Primer dimerlar

Tavlash birining 3 'uchi astar o'ziga yoki ikkinchi primerga primer kengayishiga olib kelishi mumkin, natijada past molekulyar og'irlikdagi ko'rinadigan primer dimerlari hosil bo'ladi. PCR jellari.[14] Primer dimer shakllanishi ko'pincha qiziqishning DNK qismini shakllantirish bilan raqobatlashadi va ularni etishmasligi uchun mo'ljallangan primerlardan foydalanishni oldini olish mumkin bir-birini to'ldiruvchi - ayniqsa 3 'uchlarida - o'ziga yoki reaktsiyada ishlatiladigan boshqa primerga. Agar primer dizayni boshqa omillar bilan cheklanib qolsa va agar primer dimerlari paydo bo'lsa, ularning shakllanishini cheklash usullari MgCl ni optimallashtirishni o'z ichiga olishi mumkin2 konsentratsiya yoki PCRda tavlanish haroratini oshirish.[14]

Dezoksinukleotidlar

Dezoksinukleotidlar (dNTPs) Mg ni bog'lashi mumkin2+ ionlari va shu bilan reaktsiyadagi erkin magniy ionlarining kontsentratsiyasiga ta'sir qiladi. Bundan tashqari, juda ko'p miqdordagi dNTPlar DNK polimerazasining xato darajasini oshirishi va hatto reaktsiyani inhibe qilishi mumkin.[5][6] To'rt dNTP nisbatidagi muvozanat yangi hosil bo'lgan DNK zanjiriga noto'g'ri qo'shilishga olib kelishi va DNK polimeraza sadoqatini pasayishiga yordam berishi mumkin.[15]

Adabiyotlar

  1. ^ Balin BJ, Jerar XK, Arking EJ va boshq. (1998). "Altsgeymer miyasida Chlamydia pnevmoniyasini aniqlash va lokalizatsiyasi". Med. Mikrobiol. Immunol. 187 (1): 23–42. doi:10.1007 / s004300050071. PMID  9749980. S2CID  25307947. Tahlil qilinadigan har ikkala nuklein kislota namunalari va reaktsiya aralashmalarining o'zaro ifloslanishiga yo'l qo'ymaslik uchun barcha tahlillarda o'ta ehtiyotkorlik bilan ishlangan; Bunday choralar nuklein kislotalarni laboratoriyada PCR yoki teskari transkripsiya (RT) -PCR tahlillari tashkil qilingan laboratoriyalardan alohida tayyorlash va reaktsiyalarni o'rnatish uchun har biri boshqa laboratoriyada joylashgan sakkiz xil biologik kaputdan foydalanishni o'z ichiga olgan.
  2. ^ "Polimerazalar va kuchaytirish bo'yicha savollar". Yangi Angliya Biolabs.
  3. ^ Ekkert KA, Kunkel TA (avgust 1991). "DNK polimeraza sodiqligi va polimeraza zanjiri reaktsiyasi". PCR usullari. 1 (1): 17–24. doi:10.1101 / gr.1.1.17. PMID  1842916.
  4. ^ Lundberg, Kelli S.; Oyoq tikuvchi, Dan D.; Adams, Maykl VW; Qisqa, Jey M.; Sorge, Jozef A.; Mathur, Erik J. (1991). "Pyrococcus furiosus dan ajratilgan termostabil DNK-polimeraza yordamida yuqori aniqlikdagi amplifikatsiya". Gen. 108 (1): 1–6. doi:10.1016 / 0378-1119 (91) 90480-y. PMID  1761218.
  5. ^ a b v Markoulatos P, Siafakas N, Moncany M (2002). "Multipleks polimeraza zanjir reaktsiyasi: amaliy yondashuv". J. klinikasi. Laboratoriya laboratoriyasi. Anal. 16 (1): 47–51. doi:10.1002 / jcla.2058. PMC  6808141. PMID  11835531.
  6. ^ a b v d "Nuklein kislotasini kuchaytirish protokollari va ko'rsatmalari". Arxivlandi asl nusxasi 2009-02-02 da. Olingan 2009-01-28. Iqtibos jurnali talab qiladi | jurnal = (Yordam bering)
  7. ^ Pavlov AR, Belova GI, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2002). "Helix-hairpin-helix motiflari ximerik DNK polimerazalarida tuzga chidamlilik va protsessivlikni beradi". Proc. Natl. Akad. Ilmiy ish. AQSH. 99 (21): 3510–13515. Bibcode:2002 PNAS ... 9913510P. doi:10.1073 / pnas.202127199. PMC  129704. PMID  12368475.
  8. ^ Demidov VV (2002). "Baxtli nikoh: DNK topoizomeraza qo'shimchalari bilan DNK polimerazalarini ilgarilash". Biotechnol tendentsiyalari. 20 (12): 491. doi:10.1016 / S0167-7799 (02) 02101-7.
  9. ^ Pavlov AR, Pavlova NV, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2004). "Termostabil DNK polimerazalarini samarali qo'llash uchun optimallashtirish bo'yicha so'nggi o'zgarishlar". Biotechnol tendentsiyalari. 22 (5): 253–260. doi:10.1016 / j.tibtech.2004.02.011. PMID  15109812.
  10. ^ Pavlov AR, Pavlova NV, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2004). "Inhibitorlarga yuqori qarshilik ko'rsatadigan termostabil Ximerik DNK-polimerazalar". DNKni kuchaytirish: dolzarb texnologiyalar va ilovalar. Horizon Bioscience. 3-20 betlar. ISBN  0-9545232-9-6.
  11. ^ Forterre P (2006). "DNK topoizomerazasi V: sirli kelib chiqishning yangi burmasi". Biotechnol tendentsiyalari. 24 (6): 245–247. doi:10.1016 / j.tibtech.2006.04.006. PMID  16650908.
  12. ^ Pavlov AR, Pavlova NV, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2006). "Dasturlarning keng spektri uchun termostabil DNK-polimerazalar: mustahkam gibrid TopoTaqni boshqa fermentlar bilan taqqoslash". Kieleczawa J (tahr.) Da. DNKning ketma-ketligi II: tayyorgarlik va tozalashni optimallashtirish. Jons va Bartlett. 241–257 betlar. ISBN  0-7637-3383-0.
  13. ^ "Elektron PCR". NCBI - Milliy Biotexnologiya Axborot Markazi. Olingan 13 mart 2012.
  14. ^ a b Kramer MF, Koen DM (2006 yil avgust). "PCR yordamida DNKning fermentativ kuchayishi: standart protseduralar va optimallashtirish". Curr Protoc Cytom. 3-ilova: A.3K.1 – A.3K.15. doi:10.1002 / 0471142956.cya03ks37. PMID  18770830. S2CID  4658404.
  15. ^ Kunz BA, Kohalmi SE (1991). "Mutagenezning deoksiribonukleotid darajalari bo'yicha modulyatsiyasi". Annu. Rev. Genet. 25: 339–59. doi:10.1146 / annurev.ge.25.120191.002011. PMID  1812810.