Zymoblot - Zymoblot

Zymoblot mavjud bo'lgan eng tezkor mikrotexnikasi aniqlash gen ekspressioni yoki ferment faolligi har qanday biologik namunada. Texnika professor tomonidan ixtiro qilingan Elsayed Elsayed Vagi professor bilan hamkorlikda Jaklin Fletcher O'simliklar patologiyasi bo'limining, Noble tadqiqot markazi, Oklaxoma shtat universiteti, AQSh 1993 yilda.[1]

Fon

Uyali yoki molekulyar darajadagi fiziologik hodisalar tirik organizmlar to'g'ridan-to'g'ri yoki bilvosita tomonidan boshqariladi ferment reaktsiyalari. Tahlil ferment tirik organizmlardagi harakatlar shuning uchun zamonaviy eng ko'p amalga oshiriladigan faoliyatlardan biridir fiziologiya laboratoriyalar. Ning ko'plab usullari fermentlarni tahlil qilish ferment reaktsiyalarini miqdoriy ravishda kuzatib borish uchun mavjud. Olti toifaga birlashtirilgan ushbu usullar, ya'ni spektrofotometrik, lyuminestsentsiya, nanometrik, elektrod, polarimetrik,[2] radiobiokimyoviy[3] kamchiliklari yo'q. Yaqinda birinchi bo'lib Wagih va Fletcher (1993) tomonidan tavsiflangan yangi sifatli yoki aniqroq miqdoriy mikro-texnika,[1] fermentlar faoliyatini aniqlash uchun "zymoblot" deb nomlangan spiroplazmalar va bakteriyalar va boshqa ko'plab narsalar biologik tizimlar.[4][5] Keyinchalik, texnika miqdoriy ravishda amalga oshirildi densitometriya va muvaffaqiyatli monitoring qilish uchun ishlatilgan peroksidaza faoliyat virus yuqtirilgan o'simliklar.[6]

Jarayon

Rangli mahsulot sifatida zymoblot texnikasi bilan ferment faolligini aniqlash uchun 1µl yoki undan kam miqdordagi namuna kifoya qiladi. erimaydigan, aniqlanadigan joy ustida cheklangan joyda to'planadi. Asoslangan boshqa texnikalar kolorimetriya, kattaroq bo'lishi mumkin bitiklar ishlab chiqarilgan rangli eruvchan mahsulotlar miqdori tahlil tarkibini rang berish uchun etarlicha katta bo'lishi uchun namuna kyuvet kolorimetrik o'qiladigan darajaga.

Texnikaning boshqa hech qanday texnikada bo'lmagan afzalliklari bor. Zymoblot tomonidan tahlil qilinadigan namunalar, terini yuvish uchun dializni talab qilmaydi (bu jarayon bir necha kun davom etishi mumkin). Tris tamponli sho'r suv (TBS) ularni marinadlashdan oldin reaktsiya aralashmasidan chiqarib tashlaydi inhibitörler. Namunalarni individual ravishda tahlil qilishning boshqa usullaridan farqli o'laroq, zymoblot tomonidan tahlil qilinadigan namunalar bir xil dog 'ustida aniqlanadi va ferment faolligi bir xil reaksiya aralashmasi bilan bir vaqtning o'zida tajriba xatolarini minimallashtiradi va tez sifatli taqqoslashga imkon beradi. Bundan tashqari, a da bir nechta fermentlarni tahlil qilish mumkin ketma-ket tartib xuddi shu blotda. Boshqacha aytganda, agar dog 'ma'lum bir fermentga salbiy ta'sir ko'rsatsa, uni TBS da yuvib, boshqa ferment uchun qayta ishlatish mumkin va hokazo ferment uchun ijobiy reaktsiya olinmaguncha. Nam tahlillardan (masalan, kolorimetriya) farqli o'laroq, zymoblot tomonidan olingan natijalar har doim yozilgan. Bu zymoblotlarni bir joyda amalga oshirishga imkon beradi, bu erda a densitometr mavjud bo'lmasligi mumkin va densitometriya yordamida miqdoriy tahlil qilish uchun boshqa joyga olib ketiladi yoki yuboriladi. Tadqiqotchining hamyonidagi zymoblotni uchrashuvga olib borish boshqa olimlar bilan munozaralarni va fikr almashishni osonlashtiradi. Esa immunologik jihatdan - asosli fermentlarni tahlil qilish[3] bu fermentga xosdir antikorlar fermentlarni to'g'ridan-to'g'ri aniqlash uchun fermentlarning umumiy faolligini emas, balki "fermentlarning umumiy tarkibini" o'lchashning katta kamchiliklari mavjud. serologik texnika, antikorlardan foydalanmaydi va ferment faolligini o'lchaydi, chunki u namunadagi umumiy ferment tarkibining faqat faol (funktsional) qismini aniqlaydi.

Zymoblot - bu fermentlarning reaktsiyasini o'ziga xos xususiyatlarini tezda yo'q qilish bilan to'xtatilguncha, ma'lum vaqt davomida davom ettirishga ruxsat berilgan so'nggi tahlil turi. substrat. Shu bilan birga, texnika ranglarning intensivligi vaqt o'tishi bilan asta-sekin o'sib boradigan vaqt davomida opa-singillarni inkubatsiya qilish orqali kuzatilganda doimiy fermentlarni tahlil qilish uchun moslashtirilishi mumkin. Turli namunalarni bir xil dog 'bilan taqqoslaganda, reaksiya bir muncha vaqt davomida chiziqli chiziq paytida to'xtatilishi kerak. Buni vizual ravishda ko'rib chiqish mumkin va reaksiya dog'lar orasidagi rang intensivligidagi farqlar aniqlanganda to'xtatiladi, chunki chiziqlilik ba'zi ferment reaktsiyalarida haqiqatan ham juda qisqa bo'lishi mumkin.

Ilovalar

Zymoblot texnikasi fermentlarni tahlil qilish bo'yicha barcha ma'lum protseduralarga qaraganda sodda, arzon, ishonchli va kam vaqt talab etadi. Bu har qanday biologik yoki hatto biologik bo'lmagan namunadagi ferment faolligini aniqlash uchun eng tezkor usul. Ushbu texnika sotiladigan barcha to'plamlar bilan yuqori narxga ega. Bunday afzalliklar Zymoblot texnikasini keng potentsial foydalanish uchun moslashtirishi kerak Dori, qishloq xo'jaligi va sanoat biotexnologiyasi va umuman kengroq biotexnologiya dastur. Bu odamlar, hayvonlar, o'simliklar va mikroorganizmlarning fiziologiyasini o'z ichiga olgan tadqiqotlarda, differentsial diagnostika kasalliklar va identifikatsiyalash patogenlar, biotaksonomiya organizmlar, stress va patogenez fiziologiyasi, uchun fiziologik asos kasalliklarga chidamlilik, rivojlanish fiziologiyasi va tijorat jihatdan muhim bo'lgan fermentlarni skrining va boshqa ko'plab dasturlar. Texnik, ayniqsa, ferment faolligini dastlabki sinovdan o'tkazish zarur bo'lganda foydalidir. U tirik organizmni ko'p miqdordagi fermentlarni skrining bilan bog'liq tekshiruvlarda ishlatilishi mumkin. Shuningdek, u o'qishda juda qulay bo'lishi mumkin fermentlarning tarqalishi yoki butun tanada yoki an bo'ylab ferment faolligi nuqtai nazaridan yoki to'qimalarga xos gen ekspressioni organ. Organizm yoki organning turli qismlaridan olingan namunalarni bir vaqtning o'zida tahlil qilish va taqqoslash mumkin, xuddi shu dog 'ustida, fermentlar faolligining tarqalishi to'g'risida aniq tasavvur hosil qilish mumkin. Xuddi shu soddaligi bilan, normal va biotik yoki abiotik stressli odamlardan olingan mos keladigan to'qimalarni fermentlarni stimulyatsiya qilish yoki indüksiyon bilan taqqoslash mumkin. Bundan tashqari, zymoblotlar juda foydali bo'lishi mumkin sitokemodiseksiya hujayralardagi fermentlarni lokalizatsiyalashga qaratilgan tadqiqotlar. Hujayraning turli qismlarini ifodalovchi hujayra fraktsiyalari (yadrolar, mitoxondriya, lizosomalar, peroksisomalar, Golgi tanalari, sitozol, ... va boshqalar) nisbatan qisqa vaqt ichida ko'plab fermentlarni sinab ko'rishlari mumkin.

Sifatli zymoblot odam, hayvon va o'simlik diagnostikasida katta imkoniyatlardan foydalanadi kasalliklar. Agar patogen ma'lum bir fermentni namoyish qilsa, uni uy egasi baham ko'rmasa, bu usul aniq tashxis qo'yish vositasi bo'lishi mumkin. Odatda namunada mavjud bo'lganligi ma'lum bo'lmagan fermentni aniqlash tana suyuqligi (masalan, qon zardobi, CSF, sinovial suyuqlik, sut, ko'z yoshlar ... va hokazo.) sifatli zymoblot yordamida a ko'rsatkichidir fiziologik buzuqlik, yallig'lanish reaktsiyasi yoki patogen infektsiya. Ushbu holatlarning barchasida miqdoriy zymoblot yordamida muammoning og'irligini aniqlash mumkin. Xuddi shunday, biologik suyuqliklarni turli vaqtlarda turli joylarda yoki chuqurlikda suv havzalaridan olingan (yoki shu kabi atrof-muhit manbalaridan tayyorlangan) biologik bo'lmagan suyuqliklarga almashtirish zymoblotga fermentlar faoliyatini aniqlash orqali aniqlash yoki kuzatishga imkon beradi. mikrobial yuk va natijada ushbu manbalardagi ifloslanish darajasini aniqlang.

Adabiyotlar

  1. ^ a b Vagih, Elsayed E.; Fletcher, Jaklin (1993). "Zymoblot, spiroplazmalar va bakteriyalarda fermentlar faolligini aniqlash uchun ishlatiladigan yangi mikroteknik". Kanada mikrobiologiya jurnali. 39 (5): 543–547. doi:10.1139 / m93-077.Wagih, E. E. va Fletcher, J. (1993). Spiroplazmalar va bakteriyalarda fermentlar faolligini aniqlash uchun ishlatiladigan yangi mikrotexnik Zymoblot. Kanada mikrobiologiya jurnali 39: 543-577.
  2. ^ Dikson, M. va Uebb, EC (1979). Fermentlar. 3-nashr. Longman Group Ltd.
  3. ^ a b Wiseman, A. [ed.] (1983). Ferment va fermentatsiyadagi mavzular Biotexnologiya 7. Ellis Horwood Ltd. 314pp.
  4. ^ Wagih, EE va Wagih, ME (1996). Zymoblot usuli: O'simliklar fiziologiyasidagi potentsial. Proc. O'simliklar fiziologiyasi bo'yicha 2-Osiyo-Tinch okeani konferentsiyasi, Shoh Olam, Kuala-Lumpur, Malayziya, 1996 yil 20-22 avgust.
  5. ^ Wagih, M. E., Onwueme, I. C. va Wagih, E. E. (1996). Tarodagi (Colocasia esculenta L. Scotts) differentsial peroksidaza gen ekspressionini zymoblot texnikasi yordamida aniqlash. II Xalqaro ekinshunoslik bo'yicha ilmiy kongressda. Nyu-Dehli, Hindiston, 1996 yil 17-24 noyabr.
  6. ^ Wagih, E. E. va Wagih, M. E. (1997). Zimoblot va proteinblot miqdoriy metodlari va ulardan o'simlik viruslari infektsiyalarining umumiy fermenti va eruvchan oqsil o'zgarishini kuzatishda foydalanish. 1-chi butun Afrika ekinlari bo'yicha ilmiy konferentsiya, Pretoriya, Janubiy Afrika Respublikasi, 1997 yil 13-17 yanvar.

Tashqi havolalar